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赛多利斯推出新品:2000L连续细胞培养操作系统
点击次数:5065 发布日期:2018-5-30  来源:本站 本站原创,转载请注明出处
 
在生物制药行业,连续制造通常被认为是提高生物生产效率的方法。与批处理相比,它可以在更小的设备内生产更多的产品,同时提高产品质量,尤其是对敏感和不稳定的分子。对上游和下游操作进行连续方法的相关调查表明:为将连续培养的优势充分实现,即细胞培养、收获和产品纯化必须有效地集成。这是行业内的趋势:将包括生物生产和生物过程的平台包括种子生物反应器等过程视为一个整体,统筹处理。

细胞培养操作在确定整个生产过程中起着至关重要的作用。在过去几十年中,该行业在从补料分批培养中获得更高的产品效价方面取得了很大的进展。其中一个结果是向更小的生物反应器迈进,用一次性技术取代旧的不锈钢设备。一些公司选择发展灌注过程。他们是尤其是在生产不稳定,半衰期短的治疗产品过程中,优势明显。

在灌注控制下,蛋白质可以不断地从培养容器中提取并在降解前纯化。营养物质的不断增加和有毒代谢物的去除,使灌注培养能够在数周内达到,并维持高的细胞密度。这不仅是一个高生产率的条件,而且还允许细胞保持在一个稳定的状态,并表达一致性的产品。细胞培养基质量的发展以及细胞过滤器强度的增加都为细胞连续培养起到了推动作用。

然而,该技术仍然存在一些缺点,包括长时间操作细胞培养的挑战:例如,防止污染和在收获和纯化多批次过程中一致性的验证。这些问题在新药研发过程中尤为重要。因此,一些公司决定在采用灌注模式,通过保留新的培养基和通过超滤装置去除被耗尽的培养基,从而收集产物(有时称为浓缩进料批处理模式)??梢源锏胶臀址浅8叩南赴芏?,在短时间内提供很高的生产率,而不需要额外地对多个“子批次”进行收集和纯化。

然而,连续上游操作的全部潜力尚未全部挖掘。新技术的运用,将临床前,临床,商业化规模生产的效率得到很大提高。由于可以达到如此高的滴度,一些热销的药物也会采用2000L一次性生物反应器进行生产。这样操作的优点就是省略了一个额外的放大步骤,并以此消除与时间和进一步调节过程中所产生的风险。此外,药物制造商可以利用灌注操作中,可以充分利用一次性反应器的所有优点。
 
集中分批或灌注操作
生物反应器接种和初始批处理阶段后,使用细胞截留装置,以恒定的收获流速去除无细胞上清液。同时,等量补充新鲜培养基继续培养。通过称重传感器接收信号的饲料泵或一个平台平衡来实现培养基添加的控制,这样操作员就可以保持一个确定的生物反应器重量。多种方法可以使用,包括基于营养水平来调整日常培养基添加量。

随着细胞密度的增加,营养消耗和代谢物的积累,需要提高新鲜培养基的交换率,或者,也就是每天遵循一个预设定程序进行培养基交换。在线生物量测量,提供了一种基于细胞密度信号,从而控制灌注或细胞滤出率的自动选择方法。使用在线葡萄糖和乳酸测量的生物反应器中,操作员通过添加浓缩饲料可以控制葡萄糖浓度。图1中的示意图显示了一个典型的集中灌注或分批设置。

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主要考虑因素
典型的灌注率下降到每天一至两反应器体积的范围。采用较低的细胞滤出速度可以建立恒定的细胞生长速率,并且可以维持高的存活率,进而最大限度避免细胞截留装置的堵塞。根据细胞截留膜的孔径大小或截留率,蛋白质产物将存在于在无细胞上清液(微滤灌注)中或保留在生物反应器中(超滤灌注)。由于大多数抗体是相对稳定的,所以在生物反应器中直接灌注的策略,为这种产物的积累提供了一种简单而直接的方法,增加给定抗体制造设施的空间/时间产量。对于易降解的重组蛋白,微滤灌注是一种较好的选择。那些可能表现出反馈抑制作用的产物,应尽可能快地从细胞培养中分离出来,然后在随后的纯化过程中转移到冷却的收获罐中。使用赛多利斯一次性搅拌槽生物反应器(联合多种尺寸的细胞截留装置),可以在2L体积水平进行灌注。例如,一个公司可以使用德国贝朗或b-dcu控制器,随后规模扩大过程至500L,1000L水平时,BIOSTAT STR系统。在1000升和2000-L水平,细胞截留装置(例如,Repligen的ATF系统过滤??椋┩ü桓鍪褂蒙锓从ζ靼卸弦徊喽丝?。通过生物反应器的外部环无菌连接器进行操作。

另外,Spectrum Labs和其他公司建议一次性反应器使用中空纤维???,在切向流模式下保持细胞截留。也可以使用连续离心的方式对细胞进行截留。连续离心的优点是,它避免了过滤器堵塞,并允许死细胞选择性地分离和去除。
对于所有这些选择,至关重要的是,保证外部循环尽可能短,以避免细胞培养物暴露于不受控制的环境条件,最关键的是那些与温度和溶解氧有关的(DO)因素。
 
能够增强细胞培养的一次性生物反应器装置
灌注成功的关键是高效的鼓风系统,这样可以为细胞培养提供充足的氧气。在增强的培养过程中,会形成大量的二氧化碳,必须去除,以防止抑制产物形成的或对产品质量产生的潜在的负面影响。在BIOSTAT STR一次性生物反应器中,许多微型喷头构成一个大型喷雾器,通过150微米孔,压缩空气并对其进行净化。这种一次性喷射器的??橐言诖车牟恍飧址从ζ饔τ枚嗄?。

一个不可忽视的问题是,由于高速气体流量和浓缩细胞培养液中的蛋白质含量,会导致废气排放过程中形成过多的气溶胶。一个专门开发的基于板式换热器原理设计的一次性排气冷凝器,可以减少堵塞过滤器的风险,并大大提高可靠性。赛多利斯生物反应器额外的安全联锁控制软件会防止因堵塞的细胞截留装置而导致细胞溢出。此外,所有进料泵和气流如果超过其最大工作压力,则将会中断进料。

接下来,我们将讨论两种不同的一次性2000L单抗生产生物反应器。
 
方法
美国一家大型生物技术公司评估了新系统在现有的一次性和不锈钢生物反应器在两个灌注过程中的性能。这两个过程都使用了一个普通的细胞截留装置和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系产生两种不同的单克隆抗体。2000L是最大的反应器。三叶片段叶轮低剪切力搅拌用于均匀混合。150um孔径喷头保证氧气交换率在<40h-1。经典的搅拌槽的设计保证了其使用符合单位体积内功率输入和叶尖速度等标准。几何设计的相似性,保证了赛多利斯反应器能从250ml无缝放大到2000L。

BIOSTAT STR生物反应器的袋子是用新S80多层聚乙烯薄膜。生物合成也可以用该种薄膜,其将来也可用于储存,冻融等方面。这将为公司减少开支,无需购买其他材料。在细胞培养中,S80薄膜提供可再生的细胞生长可以媲美的硼硅酸盐玻璃。这种生物反应器(包括耗材)已在1000升的规模使用CHO分批单克隆抗体的生产过程得到证实。

为了对该系统进行基准测试,并证明其与现有的一次性使用生物反应器功能的等价性,该公司使用连续细胞培养法生产单克隆抗体A。这是一个比生产单克隆抗体A更苛刻的过程,因为它产生更高的细胞密度,需要更多的氧气。这种情况对一次性生物反应器来说是很有挑战性的,因为这些生物反应器通常不能用来处理如剧烈的排气过程。 
 
结果
单克隆抗体-生物反应器的功能等价性的标杆:图2显示的是可行Biostat STR 2000 system的细胞密度(VCD)和细胞存活率(%)与现有的一次性生物反应器的历史数据比较。前者的平均数据属于这些历史数据产生的平均值正负一个标准差范围内。

图3(top)比较来自两个生物反应器的填充细胞体积数据(%)。结果表明,这两个系统具有高度的相似性。图3(bottom)packed-cell adjusted product titers显示两个系统也有很高相似性。从这些结果,我们可以得出结论,新系统在功能上等同于现有的2000-L一次性使用生物反应器。与历史数据相比,维持新系统培养点所需的氧气较少,这表明氧传递能力更好。

单抗B生产:对BIOSTAT STR进行一个更具挑战性检测: 两种单抗B生产均在过BIOSTAT STR 2000系统中完成。其中一个过程比另外一个的运行时长多25%。对于较短的过程,VCD和百分之活率与现有的一次性使用生物反应器的历史数据相比较(图4)。

Packed-cell adjusted product titer数据显示两者也有着很高的相似度。但是在该过程中,两种生物反应器存在一个明显的差异:在新系统中总的气体流量和气裹压力压力通常比其他一次性使用的生物反应器低。显然,前者的氧传递效率更高。其较低的气体流量可减少气泡破裂引起的剪切损伤,降低因泡沫堵塞排气过滤器的风险。这种新的生物反应器大的顶部空间可以进一步减轻这种风险。图5说明了两种单用生物反应器在通气性能上的差异。上述结果表明: MAb B可以用BIOSTAT STR 2000系统进行一个较长时间的生产。

整体上来看,因为一次性生物反应器的氧传递受到限制,只有在不锈钢生物反应器中才有可能。
第二组培养过程在BIOSTAT STR 2000系统(具有较长的不锈钢反应器)中进行。图6和图7显示了两者的一致性。一次性生物反应器提供的较低的总气体流量足以支持细胞生长和产物形成,显示了系统的优越氧传递。图6还显示了一次性系统在两种不同搅拌速率下的性能。显然,氧传递速率不一致性是该生物反应器的限制参数,如果能解决这个问题,则打开了更长的过程、更高的细胞密度和更高的生产率的大门。

我们已经证明,BIOSTAT STR 2000系统在连续生产单克隆抗体方面,能够提供,现有的一次性生物反应器相当的性能。由于其优越的氧转移率,所以发酵过程中只需要更少的气体。这样就降低了生物反应器中过多的泡沫和压力积聚造成排气过滤器堵塞的风险。生产第二种抗的过程中其要求更高,凭借其优越的氧转移效率,使培养物比其他一次性生物反应器运行更长的时间。新系统的工艺性能与不锈钢系统相媲美。所以BIOSTAT STR2000系统,生产单个单抗时,可以以更高的细胞密度,生产更多的单抗产品,可以的连续运行的同时保留了一次性处理所有的优点。
新兴技术应用于细胞培养过程的开发、规?;凸炭刂?。一旦这些应用与高性能、单用途的生物反应器相结合,那么极高的细胞密度培养就成为了现实。关键工艺参数的控制需要先进的过程控制软件和适当的过程分析程序。氧和二氧化碳传感器可安装与生物反应器排气线路,以监测和提供额外的观察细胞培养代谢。在连续细胞培养过程中,可以使用营养物质和代谢物如葡萄糖和乳酸的测量值来提供营养供应和培养的一般代谢状态的信息。这些信息可以帮助公司使用全自动控制回路确定最合适的营养供给率。

自动化可行的生物测量完全可以集成到一次性生物反应器中,以提供独立的生物观测信息。线测量减少了手工取样的必要。通过将这种传感器安装在生物反应器控制系统中,使在连续培养过程中自动监测和控制成为可能。
生物反应器和细胞培养技术不断发展,使细胞密度得到提高和保持。生物制药公司是否选择分批补料工艺或开发连续细胞培养方法将取决于它们各自的情况。技术创新将使他们能够加快临床试验的速度,并在预定的设计空间内开发出高滴度的抗体。
 
 
参考来源:
Continuous Cell Culture Operation at 2,000-L Scale by Christel Fenge, Nick Hutchinson, Michael Sherman, Vincent Lam and Melissa Carpio
 
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赛多利斯斯泰帝(Sartorius Stedim Biotech)是国际领先的生物制药行业设备和服务的供应商,为全球生物制药的开发与生产提供安全、及时、经济的一体化解决方案。作为完整解决方案的供应商,赛多利斯斯泰帝提供几乎涵盖生物制药工艺所有步骤的产品组合。公司致力于推广一次性使用技术和增值服务,满足生物制药行业快速发展的技术需求。公司总部位于法国欧巴涅,在巴黎的欧洲交易所上市;因其位于欧洲、北美和亚洲的生产与研发中心以及遍布全球的销售网络而享誉世界。
 
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