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应用FLIPR系统检测iCell心肌细胞钙振荡
点击次数:3634 发布日期:2017-10-31  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

炸金花的技巧 www.07zt.com.cn 简介

药物有效性和安全性筛选成本的持续增加导致了对创新技术的需求,从而在药物发现过程中更早地进行表征和特性的检测分析。FDA正在制定化合物检测的指导方针,以确保药物的安全性,使得药物无需因为不良反应而撤市, 例如阻断心脏hERG通道,并导致像尖端扭转型室性心律失常这样的症状。这一方向被称为全面的体外心律失常试验或CiPA项目。诱导多能干细胞(iPSC)分化的心肌细胞因其用于评估对心脏功能和安全性的复合作用,在体外模型系统被广泛使用。钙信号振荡的结果可以反映细胞内钙离子浓度的变化, 从而可以使用钙敏感染料如EarlyTox™荧光染料试剂盒进行信号的检测。ScreenWorks®Pro软件可以分析心肌细胞跳动峰值的频率,峰值10%的振幅峰宽,以及其他参数以高通量筛选的方式来描述化合物影响心肌细胞。

干细胞公司CDI (Cellular DynamicsInternational) 已经开发了一种增强版的iPSCs分化的心肌细胞,其复苏后恢复的速度比之前版本的iPSCs更快。这样的改进使得在FLIPR Tetra 高通量实时荧光检测分析系统上检测化合物对跳动的心肌细胞钙瞬变信号影响的工作流程缩短生长时间5 - 7天。图1是示例的工作流程。本文中我们阐述了一些癌症化合物的检测,其中一些已知会影响hERG通道,其它化合物已知可以阻断hERG通道。

优势

• 缩短细胞培养时间,提高实验的工作流程和质量
• 在药物发现过程中更早地发现可能导致安全问题的化合物
• ScreenWorks Peak Pro软件简化数据分析

材料

• iCell® Cardiomyocytes2 试剂盒,包括细胞、铺板培养基和维持培养基 (Provided byCellular Dynamics, International)
• 0.1% (w/v) 明胶
• 384孔黑壁底透多孔板 (Corning PN 3712)
• EarlyTox 心肌细胞毒性检测试剂盒(Molecular Devices PN R8210)
• 测试化合物和DMSO (Sigma Aldrich)
• FLIPR Tetra 高通量实时荧光检测分析系统(Molecular Devices)

 

 

准备iCell心肌细胞多孔板

在iCell心肌细胞使用指南的指导下,用0.1%的明胶包被384孔黑壁底透多孔板。iCell心肌细胞复苏后以8000个细胞每孔的密度铺在每孔25μL的培养基中。细胞在37°C、5% CO2、以及100%湿度条件下培养24小时。细胞形成单层并更换成维持培养基。细胞每隔一天更换一次维持培养基。在第5天,细胞开始同步跳动并可以用于实验。

准备化合物板用于筛选检测

为便于筛选检测,化合物溶于100% DMSO配置成10 MM的母液。维持培养基稀释母液至10-100 μM的检测浓度。在使用FLIPRTetra系统检测前,提前24小时将稀释好的化合物溶液添加到每个孔中。DMSO在培养基中的最终浓度为0.15%(v / v)。浓度范围从30或100μM对数稀释的每个浓度的化合物进行两次(n = 2)或三次(n = 3)的检测。

使用FLIPR Tetra系统观察钙振荡

实验前24小时,以终浓度30μM开始的对数稀释的各种化合物加入到iPSC 心肌细胞中。检测之前两个小时25μL体积的溶于维持培养基的2倍浓度的EarlyTox心肌细胞毒性检测染料添加到每孔中,并在37°C、5% CO2条件下孵育。当细胞从培养箱取出后,钙离子浓度的变化会随着细胞的振荡而变化,从而引起FLIPR Tetra系统所记录的荧光信号的改变。在ScreenWorks工作软件中的实验方案和参数设置如表1所示。数据分析使用了ScreenWorks PeakPro软件???,并在GraphPad Prism 6中绘制了图形。

 

化合物对心肌细胞跳动的峰值参数的影响

用FLIPR Tetra系统在化合物添加24小时后进行钙振荡信号的检测和记录。iPSC2s与之前版本的iPSCs以相同的方式进行实验,通过形成缝隙连接并同步振荡,检测到钙敏感染料指示的峰值频率。新型细胞比之前版本的细胞可提早4-5天用于检测实验,同时因其更低的污染风险和一个整体较短的时间周期并得到类似的结果,明显改善了筛选的工作流程。用于实验研究的抗肿瘤化合物包括:舒尼替尼、伊马替尼和星形孢菌素(由于毒性原因而不作临床使用的化合物)均是激酶抑制剂;白消安,一个烷基磺酸盐;阿霉素,一种蒽环类药物;依托泊苷,一种拓扑异构酶II抑制剂;而紫杉醇会干扰细胞管蛋白的生成。在化合物添加24小时后,一些钙振荡信号变化明显异于对照组(图2)。舒尼替尼的振荡频率较低,且在10%峰值高度的峰宽显著大于对照组。其它具有相似钙振荡结果的抗癌化合物包括伊马替尼(Imatinib)和星形孢菌素(Staurosporine)。这三种化合物与阻断hERG通道有关。hERG基因编码了钾通道,有助于心脏跳动的恢复,其被阻断有可能引起长QT综合征或尖端扭转型室性心律失常。紫杉醇、白消安和依托泊苷未知有hERG活性,且没有类似的钙振荡减慢效应,也没有10%峰值高度的峰宽增大的效应。量效曲线显示,24小时暴露于阿霉素和舒尼替尼后峰值频率显著降低。紫杉醇也是一种不影响峰值频率的化合物(图3)。除抗癌化合物外,已知的hERG阻断剂氟哌利多,一种抗精神病药物和多巴胺受体阻断剂;阿米替林,三环抗抑郁药和5-羟色胺受体抑制剂;以及西沙必利,一种抗酸剂,均是已知的可导致长QT综合征。此三种化合物也都在实验中进行了检测。在24小时内加入iPSC2s时,这三种化合物的峰值频率都在降低以及10%峰值高度的峰宽增大(图4)。在钙振荡测定中所测试的所有化合物的IC50值的总结如表2所示。

 

 

结论

iPSC2心肌细胞可实现在细胞解冻后的4 - 5天内,而不是10 - 14天进行实验,从而改善了在FLIPR Tetra系统上进行筛选检测的工作流程。ScreenWorks Peak Pro软件??榭梢酝ü愿普竦葱藕诺募锹己头治?,非常便捷地证实化合物对心肌细胞的效应,是药物筛选过程中的有效工具。这样的试验可以在药物开发早期进行,有助于在进入先导化合物开发流程之前发现可能对心脏产生不利或有益影响的化合物。

参考文献:

1. Sirenko, Oksana, et al. “Phenotypic Assaysfor Characterizing Compound Effects onInduced Pluripotent Stem Cell-DerivedCardiac Spheroids.” ASSAY and DrugDevelopment Technologies, vol. 15, no. 6,2017, pp. 280‒296., doi:10.1089/adt.2017.792.
2. Sirenko, Oksana, et al. “Invitrocardiotoxicityassessmentofenvironmentalchemicalsusinganorganotypic human induced pluripotentstem cell-Derived model.” Toxicology andAppliedPharmacology, vol. 322, 2017, pp.60‒74., doi:10.1016/j.taap.2017.02.020.
3. Sirenko, Oksana, et al. “Assessment ofbeating parameters in human inducedpluripotent stem cells enables quantitative invitro screening for cardiotoxicity.”Toxicology and Applied Pharmacology, vol.273, no. 3, 2013, pp. 500‒507.,doi:10.1016/j.taap.2013.09.017.
4. “iCell Cardiomyocytes2 User Guide.”Cellular Dynamics International, Aug 2016.

来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
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