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蛋白质技术专题:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达
点击次数:360 发布日期:2019-2-26  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
[实验原理]
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)是蛋白分析中经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)以及巯基乙醇一起加热,使蛋白变性,多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原,肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷,电泳时在电场作用下,肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同,在迁移过程中逐渐分开,其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。

pGLO是将绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体。携带有pGLO的大肠杆菌在含有相应诱导物和素的条件下培养,可以表达GFP,这比不加诱导物的同样的大肠杆菌在SDS—PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿色荧光条带出现?;箍梢酝ü?*印迹染色(Western—blotting)的方法,用GFP的抗体检测表达的外源蛋白。

[仪器、材料和试剂]

(一)仪器
1.垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子
2.电泳仪
3.干式恒温培养器
4.微波炉

(二)材料
1. pGLO表达质粒转化的大肠杆菌的培养物:用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱导的

(三)试剂
1.1.5mo1/L  Tris-HCl pH 8.8  (已加SDS )
2.0.5mo1/L  Tris-HCl pH 6.8  (已加SDS)
3.10%SDS
4.30%Acr/Bis  29.2g Acr + 0.8gBis,用双蒸水定容至100mL,过滤备用,4℃存放。
5.10%Ap (-20℃存放)
6.2x样品缓冲液

0.5mo1/L Tris-HCl pH6.8       2mL
甘油                           2mL
20%SDS                       2mL
0.1%溴酚蓝                    0.5mL
2—?—巯基乙醇                 l.0mL
双蒸水                         2.5mL

7.5x电极缓冲液
Tris      7.5g
G1y     36 g
SDS      2.5g

双蒸水溶解,定容至500mL,使用时稀释5倍使用

8.染色液:0.2g考马斯亮蓝R250 + 84mL 95%乙醇 + 20mL冰醋酸,定容至200mL,过滤备用。
9.脱色液: 酒精:冰醋酸:水=7.5:7.5:85

[实验步骤]

1.装配做胶用的玻璃板"三明治":做1.0mm厚的胶。选择两侧的玻璃夹条为1mm的玻璃板,将其夹条面朝上平放在桌面上,把灰色的U形硅胶夹条在上面摆好,然后把带两个“耳朵”的凹玻璃放在上面,使U形硅胶夹条平整、服帖地夹在两块玻璃板之间。小心地把这玻璃板“三明治”放到“提篮架子”上,用塑料的“楔子”夹紧,注意底部的U形硅胶夹条在夹紧的过程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夹缝加满蒸馏水,检验是否漏,如果漏水必须重装。
2.配制浓度为12%的分离胶 (凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择),配方如下:

双蒸水                           3.3 mL
1.5mo1/L Tris-HCl (pH 8.8)       2.5 mL
Acr/Big(30%)                   4.0 mL
10% SDS                        100 μL
TEMED                           10 μL
10%AP                          100 μL
总体积                           10 mL (刚好灌制两块胶)

混匀后加入两玻璃夹缝中,并小心在胶面上加入1cm蒸馏水(在胶面上加蒸馏水称水封,目的是保持胶面平整,并防止胶与空气接触,影响胶的聚合),室温放置,等胶自然凝聚后(此时在胶面与水封之间可见清晰的界限),将水封倾去。这时可以开始配制4%的浓缩胶,配方如下:

双蒸水                         1.8 mL
0.5mo1/L Tris-HCl pH 6.8       0.75mL
Acr/Bis (30%)                  0.4 mL
10% SDS                        30 μL
TEMED                           5μL
10%Ap                           30μL
总体积                         3.0 mL (够做两块板的浓缩胶)

混匀后加入到"三明治"玻璃板的夹缝中,然后在把1mm的梳子**浓缩胶中,注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡,一定要想法去掉(可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等),否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后,小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲,用注射器的针头小心加以整理,使之齐整。

3.培养物SDS-PAGE样品的制作:同时做L-阿拉伯糖诱导的和未加L-阿拉伯糖的两个大肠杆菌样。取培养物1.5mL加到1.5mL小离心管中,12000r/m离心3分钟,去上清。在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水,用枪头小心地吹打,使充分悬浮,直到没有明显的小团块,然后加入等体积的2×样品缓冲液,在100℃沸水浴(或干式培养器)中保温5min。此时如用枪头吸取样品,会发现非常粘稠,呈鼻涕状,这是因为有样品中含有大量DNA的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出,反复多次才能将DNA分子打断,使样品变得不再粘稠为止。将样品14000r/m离心5分钟,使不溶物沉淀下来,小心吸取上清加样。电泳样品的处理直接关系到电泳结果的好坏,一定要认真做样,否则跑不出好胶来。

4.琼脂封底:做好胶后,把玻璃板“三明治”从架子中取出,将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉。去掉夹条后在凝胶的底部会留下一空隙,此空隙要用2%融化的琼脂填满,否则在玻璃板浸到电极缓冲液后空隙中的空气将很难彻底排除掉,电泳时会明显影响导电,严重时会使整个电泳失败。琼脂封底时注意不要产生气泡。

5.电泳槽组装:封底后将玻璃板“三明治”凹玻璃面向内重新装到“提篮架子”上,固定好后,将整个部件放到电泳槽的外壳中,然后加电极缓冲液。加液时要使内外槽中的液面基本等高,内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm,以保证能够导电,且电场均匀。

6.加样:按事先设计好的顺序与加样量依次加样。在样品的浓度未知的情况下,同一样品可加一梯度,即每一泳道的加样量依次减半。这样,在做第二次电泳时可以其作为参考,正确加样。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中,也可加在离边的第2道处(靠边的一道样品往往会明显跑斜)。

7.电泳:将电泳槽的盖子盖上,把电泳槽的两个电极接到电泳仪上(注意电极不要接错),然后接通电源。先将电压调到80V,当样品进入分离胶时,调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时,关掉电源,停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出,小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板,暴露出胶面。将浓缩胶部分去掉不要,分离胶放到塑料盒中染色。

8.染色和脱色:凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色20分钟(摇床上缓慢振荡),然后倾去染色液(染色液回收,可反复用数十次),用自来水洗几下,去掉凝胶上和塑料盒中的染色残液,加脱色液脱色(摇床上缓慢振荡),1小时后换一次脱色液,振荡脱色过夜。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰,背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描,作为记录。
来源:上海嘉鹏科技有限公司
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